Способна ли медицина использовать все то, что имеется в настоящее время? Поможет ли новая серия соединений при решении лечебных проблем?
Все эти вопросы неоднократно ставились на протяжении последних 15 лет, но пока можно сделать лишь один вывод: новые производные и аналоги будут использованы и даже помогут в решении указанной проблемы.
Анализ клинического применения антибиотиков показывает, что в конечном итоге из каждой тысячи изученных препаратов используется в лучшем случае только один.
Предполагают, что происхождение этих механизмов как у микробов-продуцентов,, так и у клинических изолятов может быть связано с переносимыми плазмидами. Если это на самом деле так, то можно ожидать, что способы биотрансформации будут найдены для всех антибиотиков.
Широкое применение антибиотиков в качестве добавки к корму явилось основной причиной, обусловившей возникновение той картины резистентности, которую мы наблюдаем в клинике и повсюду.
Вместе с наукой об окружающем нас мире, которая объединяет все дисциплины, вся наука, таким образом, оказывается связанной с сельскохозяйственной наукой, а следовательно, с сельским хозяйством.
Термины «антибиоз» и «антибиотик» были введены Вильемином примерно в 1889 г. [235]. В современном понимании слово антибиотик используется, очевидно, благодаря Ваксману [236], который в своей автобиографии в 1941 г.
В результате был разработан препарат прогуанил (хлоргуанидин-гидрохлорид), который, как было установлено позже, после метаболических превращений в организме хозяина действовал как антифолат, т. е. в виде активного метаболита 4,6-диамино-1-п-хлорфенил-2,2-диметил-(1,2-дигидро-1,3,5-триазина) [27, 51].
Хотя 2,4-диаминопиримидины как отдельный класс соединений являются антифолатами, их поведение в разных биологических системах варьирует в зависимости от природы замещающего радикала в положениях 5 и 6 [59].
дигидрофолатредук-тазы и снижением ее сродства к ТМП [2,84]. По данным Грюнберга [48], штаммы с плазмидами не проявляют повышенной чувствительности к этой комбинации антибиотиков, чем отличаются от других ТМП-резистентных штаммов. Передача ТМП-резистентности этим путем впервые была показана Либеком [65], однако до сих пор нет убедительных данных о том, что появление R-фактора послужило причиной широкого распространения резистентности к ТМП +СМЗ по крайней мере в Англии, где комбинирование этих препаратов применяется с 1968 г.
После импульсного введения СМЗ при исходной концентрации 500 мкг/мл, {50 МИК) не оказал никакого влияния на нормальную реакцию культуры на ее разведение, тогда как ТМП при исходной концентрации 50 мкг/мл (5 МИК) проявлял кратковременное воздействие 16].
При непрерывном введении СМЗ с бульоном (действие СМЗ в обычных тестах in vitro зависит от объема инокулята) препарат подавлял рост плотной бактериальной популяции (>108 бактеий/мл) через несколько часов, причем даже при концентрациях меньших, чем МИК, определяемая обычным способом (рис.
Данные, полученные в Японии [148], СССР [126], Индии [75] и в Чехословакии [56], подтвердили пригодность низина при изготовлении сыра в различных условиях. Лишь в одном случае не было отмечено значительного влияния 100—400 ИЕ/г низина на сохраняемость переработанного сыра, изготовленного в лабораторных условиях [154]. Кроме того, применение низина оказалось благоприятным для продления срока хранения постных, пастообразных продуктов [28].
В качестве закваски были использованы низинпродуцирующие молочнокислые стрептококки. К тому времени маслянокислое брожение в производстве твердых и полутвердых сычужных сыров получило широкое распространение во всех странах, где производились разновидности этого сыра. Связано это было с увеличением кормления скота силосом, причем не всегда высокого качества. Виды Clostridium, вызывающие задержку образования газов в сырах, из такого силоса попадали в молоко и затем в сыр.
Произведенный через 1—2 недели подсчет клеток по методу Милз-Мирза показал (табл. 10.2), что при рН 3,5 выживание было ниже определимого уровня, при рН 4 и 4,5 бактерии выживали, но число их через 2 недели сокращалось. Величина рН выше 5,5 не оказывала неблагоприятного влияния на выживаемость микроорганизмов.
О влиянии рН на Staph, aureus в сырном зерне сыра стилтон судили по терморезистентности шести штаммов бактерий при разном рН (все они относились к группе штаммов, отравляющих продукты) .
10.4).
Полученные результаты были подтверждены в опыте, когда эти штаммы, дополненные другой парой штаммов (казеинолитический и неказеинолитический), выделенных от здоровых людей, культи-
вировали в незабуференном разведенном сухом снятом молоке при температуре 22 °С в течение восьми дней. В результате было установлено (рис. 10.7), что исходное значение рН, равное 6,7, казеинолитический штамм снижает до 5,7—5,8, а неказеинолити-ческий—-до 5,3—5,4.
величины D). Величина D соответствует времени или в случае облучения дозе, необходимым для уменьшения в данных конкретных условиях числа микроорганизмов на 90 %.Допуская возможность отклонения от линейной зависимости, мы полагаем, что для оценки воздействия следует использовать такие концентрации вещества, которые вызывают уменьшение количества обрабатываемых клеток на 7—12 десятичных логарифмов. Такой подход исключает необходимость интерпретации многофазной кривой и обоснования подобранной по ней наиболее эффективной дозы, достаточной для получения определенного эффекта [76].
Это обычно достигается за счет использования селективной и неселективной жидкой и (или) твердой среды для подсчета общего количества поврежденных клеток, а также суммы поврежденных и неповрежденных клеток соответственно. Количество клеток, которые будут определяться как поврежденные, зависит, конечно, от выбора среды, использованной для такой оценки (см. ниже).
На рисунке 12.1 показан типичный график опыта повреждение— восстановление [119, 129].
coli и Salmonella.
воспроизводиться в каждом случае, ясно одно, что свиньи при промышленном откорме находятся под постоянной угрозой заражения. Поэтому поддержание санитарного благополучия животных зависит от эффективности профилактических мероприятий, направленных против патогенных микроорганизмов.
Во втором сообщении Консультационной организации сельского хозяйства и пищевой промышленности (Rand D) ключевая роль отведена некоторым проблемам при воспроизводстве животных, причем две из них имеют существенное значение для рассматриваемого здесь вопроса: 1) гибель новорожденных животных; 2) энтеро- и респираторные болезни.
Поэтому первоначальный выбор антибиотика во многом является эмпирическим, но тем не менее осмысленным; и позже мы увидим, насколько возрастает значение заключительного анализа, если образцы для лабораторных исследований отобраны вовремя, но при условии, что первоначальное лечение оказалось не способным принести ожидаемого клинического облегчения. Полученная, таким образом, информация становится необходимой для анализа любого из возможных случаев вспышки того же заболевания в будущем, которое может наступить вскоре после первого, тем более что при интенсивном групповом содержании животных это вполне вероятно.
Учитывая ограниченность выбора, при лечении скота предпочтение отдается препарату с подходящим спектром активности, и его вводят в больших дозах.
Клинические данные нельзя рассматривать как один из менее важных или менее необходимых факторов, влияющих на выбор антибиотиков для применения в ветеринарии. Они имеют значение при первоначальном определении лечебных мероприятий, когда для оценки распространенности заболевания существенными бывают такие факторы, как точное выяснение природы эпизоотии или эпизоотической ситуации в отдельных хозяйствах.
Мы должны также спросить себя: почему терапия в сухостойный период не рекомендуется в такой стране, как Дания? Причина состоит в том, что положительное применение субтерапевтических доз антибиотика может, по мнению некоторых исследователей [28], ускорить появление резистентных штаммов. Тем не менее резистентные штаммы появлялись во многих странах задолго до введения терапии в сухостойный период, так что указанное объяснение не может быть достаточным.
Наиболее широко проблема возникает в связи с терапией в период лактации, когда основным определяемым остатком является пенициллин. Для идентификации остатков антибиотиков применяется множество лабораторных тестов: Галлеслота и Хассинга, ТТС, анализ с применением дисков, интертест, делвотест, восстановление краски бриллиантовой черной и с недавнего времени газовая хроматография. Следует отметить, что определение чувствительности микробов к препарату зависит от используемого метода.
Пять тем, рассмотренных в данной статье, по-видимому, достаточны для стимуляции соответствующей дискуссии относительно наших достижений и будущих задач. Одна из первых проблем, рассматриваемых в этой статье, касается вопроса, насколько успешной окажется принятая схема ликвидации Strep, agalactiae в Англии. Во многих индивидуальных стадах удалось добиться полного искоренения этой инфекции, тогда как другие приобрели новые и более устойчивые инфекции, третьи остались благополучными, поэтому общий обзор положения по стране представляется совершенно необходимым.
При разработке мазей в 70-х годах были учтены эти изменения в этиологии возбудителя, а также достигнутые успехи в профилактике маститов. В течение многих лет использовался комплексный препарат стрептомицина с пенициллином, содержащий по 100 или 300 мг каждого антибиотика, но пока неизвестны комбинации препаратов, в которых содержание каждого антибиотика превышало бы 1 г. Комплексные препараты обеспечивают высокий уровень антибиотиков в вымени.
При использовании трехкомнонентной смеси число возможных вариантов становится равным семи. Для каждого из этих вариантов можно ввести свое обозначение (термин). Однако это не упрощает существо вопроса, особенно в случае смесей с возрастающим числом компонентов. Проще всего при разборе этих вариантов называть их категориями совместного действия, т. е. первой, второй, третьей, четвертой и пятой категориями, как это указано на рисунках 23.
Основная кривая для вещества А говорит о неопровержимой истине, что количество вещества А, например, при смешивании в соотношении 75 % А и 25 % В составляет три четверти от 100 %А. Таким образом,, мы приходим к заключению, что приемлемые определения аддитивности, а следовательно, и синергизма, и антагонизма могут-быть основаны только на сложении показателей массы препаратов (рис. 23.5).
Пример опыта in vivo может проиллюстрировать значение-всего сказанного.
Чашки до инкубации пс охлаждали, так как в случае высоких концентраций это несущественно. Активность комбинированного препарата сравнивали с активностью его компонентов (6 зон, из них 2 комбинированного препарата и по 2 каждого компонента).
Используя в первую очередь штамм В (и затем 7 других для сравнения), была установлена возможность построения калибровочной кривой на основе зависимости радиуса зоны ингибирования (16-часовая инкубация при37°С) от логарифма концентрации (мкг в 0,02 мл) для ампициллина, пенициллина G, метициллина, фене-тициллина, клоксациллина, канамицииа, неомицина, нитрофуран-тоина, полимиксина В, тетрациклина, стрептомицина, эритромицина, новобиоцина и хлорамфеникола.
Исходя из этого положения, животных забивают, отбирают соответствующие ткани и исследуют наиболее чувствительным методом содержание антибиотиков. В случае обнаружения пенициллина следующую группу животных забивают по истечении более длительного срока после введения препарата;, такую процедуру повторяют до получения отрицательных результатов.
Вопрос персистенции остатков антибиотиков в молоке после использования полусинтетических пенициллинов для интрацистернального введения при лечении клинических форм маститов у коров представляет большой интерес как для фермеров, так и для фармацевтической промышленности.
Хотя эту точку зрения разделяют многие исследователи, тем не менее ко времени публикации указанных рекомендаций обоснованность такого мнения не была столь очевидной. Дополнительные данные в поддержку рекомендаций появились позже, но их пока недостаточно.
Несмотря на интенсивные исследования по распространению резистентных к антибиотикам форм Е. coli среди домашних животных и человека, много вопросов остается без ответа.
А. Загрязнение бактериями туш красного мяса. Из всего набора микроорганизмов, обнаруженных в сыром мясе, туша может быть загрязнена кишечной флорой скорее всего при убое животных [68]. Установлено, что 52 % бычьих и 83 % свиных туш животных, убитых на коммерческих бойнях, были загрязнены Е. coli [106]. По данным американских исследователей, из 98 изолятов, выделенных из освежеванных бычьих туш, 79,6 % оказались резистентными хотя бы к одному антибактериальному агенту [11].
табл. 26. 1). Без использования селективной среды резистентные штаммы от людей выделялись редко. Современное состояние проблемы резистентности среди животных несомненно является следствием значительного и многолетнего применения антибиотиков в разных целях. Наличие большого числа резистентных к антибиотикам О-серотипов, причем значительного числа штаммов с множественной резистентностью, говорит о широком проникновении R-ллаз-мид в микрофлору кишечника животных.
Способна ли медицина использовать все то, что имеется в настоящее время? Поможет ли новая серия соединений при решении лечебных проблем?
Все эти вопросы неоднократно ставились на протяжении последних 15 лет, но пока можно сделать лишь один вывод: новые производные и аналоги будут использованы и даже помогут в решении указанной проблемы.
Анализ клинического применения антибиотиков показывает, что в конечном итоге из каждой тысячи изученных препаратов используется в лучшем случае только один.
Предполагают, что происхождение этих механизмов как у микробов-продуцентов,, так и у клинических изолятов может быть связано с переносимыми плазмидами. Если это на самом деле так, то можно ожидать, что способы биотрансформации будут найдены для всех антибиотиков.
Широкое применение антибиотиков в качестве добавки к корму явилось основной причиной, обусловившей возникновение той картины резистентности, которую мы наблюдаем в клинике и повсюду.
Вместе с наукой об окружающем нас мире, которая объединяет все дисциплины, вся наука, таким образом, оказывается связанной с сельскохозяйственной наукой, а следовательно, с сельским хозяйством.
Термины «антибиоз» и «антибиотик» были введены Вильемином примерно в 1889 г. [235]. В современном понимании слово антибиотик используется, очевидно, благодаря Ваксману [236], который в своей автобиографии в 1941 г.
В результате был разработан препарат прогуанил (хлоргуанидин-гидрохлорид), который, как было установлено позже, после метаболических превращений в организме хозяина действовал как антифолат, т. е. в виде активного метаболита 4,6-диамино-1-п-хлорфенил-2,2-диметил-(1,2-дигидро-1,3,5-триазина) [27, 51].
Хотя 2,4-диаминопиримидины как отдельный класс соединений являются антифолатами, их поведение в разных биологических системах варьирует в зависимости от природы замещающего радикала в положениях 5 и 6 [59].
дигидрофолатредук-тазы и снижением ее сродства к ТМП [2,84]. По данным Грюнберга [48], штаммы с плазмидами не проявляют повышенной чувствительности к этой комбинации антибиотиков, чем отличаются от других ТМП-резистентных штаммов. Передача ТМП-резистентности этим путем впервые была показана Либеком [65], однако до сих пор нет убедительных данных о том, что появление R-фактора послужило причиной широкого распространения резистентности к ТМП +СМЗ по крайней мере в Англии, где комбинирование этих препаратов применяется с 1968 г.
После импульсного введения СМЗ при исходной концентрации 500 мкг/мл, {50 МИК) не оказал никакого влияния на нормальную реакцию культуры на ее разведение, тогда как ТМП при исходной концентрации 50 мкг/мл (5 МИК) проявлял кратковременное воздействие 16].
При непрерывном введении СМЗ с бульоном (действие СМЗ в обычных тестах in vitro зависит от объема инокулята) препарат подавлял рост плотной бактериальной популяции (>108 бактеий/мл) через несколько часов, причем даже при концентрациях меньших, чем МИК, определяемая обычным способом (рис.
Данные, полученные в Японии [148], СССР [126], Индии [75] и в Чехословакии [56], подтвердили пригодность низина при изготовлении сыра в различных условиях. Лишь в одном случае не было отмечено значительного влияния 100—400 ИЕ/г низина на сохраняемость переработанного сыра, изготовленного в лабораторных условиях [154]. Кроме того, применение низина оказалось благоприятным для продления срока хранения постных, пастообразных продуктов [28].
В качестве закваски были использованы низинпродуцирующие молочнокислые стрептококки. К тому времени маслянокислое брожение в производстве твердых и полутвердых сычужных сыров получило широкое распространение во всех странах, где производились разновидности этого сыра. Связано это было с увеличением кормления скота силосом, причем не всегда высокого качества. Виды Clostridium, вызывающие задержку образования газов в сырах, из такого силоса попадали в молоко и затем в сыр.
Произведенный через 1—2 недели подсчет клеток по методу Милз-Мирза показал (табл. 10.2), что при рН 3,5 выживание было ниже определимого уровня, при рН 4 и 4,5 бактерии выживали, но число их через 2 недели сокращалось. Величина рН выше 5,5 не оказывала неблагоприятного влияния на выживаемость микроорганизмов.
О влиянии рН на Staph, aureus в сырном зерне сыра стилтон судили по терморезистентности шести штаммов бактерий при разном рН (все они относились к группе штаммов, отравляющих продукты) .
10.4).
Полученные результаты были подтверждены в опыте, когда эти штаммы, дополненные другой парой штаммов (казеинолитический и неказеинолитический), выделенных от здоровых людей, культи-
вировали в незабуференном разведенном сухом снятом молоке при температуре 22 °С в течение восьми дней. В результате было установлено (рис. 10.7), что исходное значение рН, равное 6,7, казеинолитический штамм снижает до 5,7—5,8, а неказеинолити-ческий—-до 5,3—5,4.
величины D). Величина D соответствует времени или в случае облучения дозе, необходимым для уменьшения в данных конкретных условиях числа микроорганизмов на 90 %.Допуская возможность отклонения от линейной зависимости, мы полагаем, что для оценки воздействия следует использовать такие концентрации вещества, которые вызывают уменьшение количества обрабатываемых клеток на 7—12 десятичных логарифмов. Такой подход исключает необходимость интерпретации многофазной кривой и обоснования подобранной по ней наиболее эффективной дозы, достаточной для получения определенного эффекта [76].
Это обычно достигается за счет использования селективной и неселективной жидкой и (или) твердой среды для подсчета общего количества поврежденных клеток, а также суммы поврежденных и неповрежденных клеток соответственно. Количество клеток, которые будут определяться как поврежденные, зависит, конечно, от выбора среды, использованной для такой оценки (см. ниже).
На рисунке 12.1 показан типичный график опыта повреждение— восстановление [119, 129].
coli и Salmonella.
воспроизводиться в каждом случае, ясно одно, что свиньи при промышленном откорме находятся под постоянной угрозой заражения. Поэтому поддержание санитарного благополучия животных зависит от эффективности профилактических мероприятий, направленных против патогенных микроорганизмов.
Во втором сообщении Консультационной организации сельского хозяйства и пищевой промышленности (Rand D) ключевая роль отведена некоторым проблемам при воспроизводстве животных, причем две из них имеют существенное значение для рассматриваемого здесь вопроса: 1) гибель новорожденных животных; 2) энтеро- и респираторные болезни.
Поэтому первоначальный выбор антибиотика во многом является эмпирическим, но тем не менее осмысленным; и позже мы увидим, насколько возрастает значение заключительного анализа, если образцы для лабораторных исследований отобраны вовремя, но при условии, что первоначальное лечение оказалось не способным принести ожидаемого клинического облегчения. Полученная, таким образом, информация становится необходимой для анализа любого из возможных случаев вспышки того же заболевания в будущем, которое может наступить вскоре после первого, тем более что при интенсивном групповом содержании животных это вполне вероятно.
Учитывая ограниченность выбора, при лечении скота предпочтение отдается препарату с подходящим спектром активности, и его вводят в больших дозах.
Клинические данные нельзя рассматривать как один из менее важных или менее необходимых факторов, влияющих на выбор антибиотиков для применения в ветеринарии. Они имеют значение при первоначальном определении лечебных мероприятий, когда для оценки распространенности заболевания существенными бывают такие факторы, как точное выяснение природы эпизоотии или эпизоотической ситуации в отдельных хозяйствах.
Мы должны также спросить себя: почему терапия в сухостойный период не рекомендуется в такой стране, как Дания? Причина состоит в том, что положительное применение субтерапевтических доз антибиотика может, по мнению некоторых исследователей [28], ускорить появление резистентных штаммов. Тем не менее резистентные штаммы появлялись во многих странах задолго до введения терапии в сухостойный период, так что указанное объяснение не может быть достаточным.
Наиболее широко проблема возникает в связи с терапией в период лактации, когда основным определяемым остатком является пенициллин. Для идентификации остатков антибиотиков применяется множество лабораторных тестов: Галлеслота и Хассинга, ТТС, анализ с применением дисков, интертест, делвотест, восстановление краски бриллиантовой черной и с недавнего времени газовая хроматография. Следует отметить, что определение чувствительности микробов к препарату зависит от используемого метода.
Пять тем, рассмотренных в данной статье, по-видимому, достаточны для стимуляции соответствующей дискуссии относительно наших достижений и будущих задач. Одна из первых проблем, рассматриваемых в этой статье, касается вопроса, насколько успешной окажется принятая схема ликвидации Strep, agalactiae в Англии. Во многих индивидуальных стадах удалось добиться полного искоренения этой инфекции, тогда как другие приобрели новые и более устойчивые инфекции, третьи остались благополучными, поэтому общий обзор положения по стране представляется совершенно необходимым.
При разработке мазей в 70-х годах были учтены эти изменения в этиологии возбудителя, а также достигнутые успехи в профилактике маститов. В течение многих лет использовался комплексный препарат стрептомицина с пенициллином, содержащий по 100 или 300 мг каждого антибиотика, но пока неизвестны комбинации препаратов, в которых содержание каждого антибиотика превышало бы 1 г. Комплексные препараты обеспечивают высокий уровень антибиотиков в вымени.
При использовании трехкомнонентной смеси число возможных вариантов становится равным семи. Для каждого из этих вариантов можно ввести свое обозначение (термин). Однако это не упрощает существо вопроса, особенно в случае смесей с возрастающим числом компонентов. Проще всего при разборе этих вариантов называть их категориями совместного действия, т. е. первой, второй, третьей, четвертой и пятой категориями, как это указано на рисунках 23.
Основная кривая для вещества А говорит о неопровержимой истине, что количество вещества А, например, при смешивании в соотношении 75 % А и 25 % В составляет три четверти от 100 %А. Таким образом,, мы приходим к заключению, что приемлемые определения аддитивности, а следовательно, и синергизма, и антагонизма могут-быть основаны только на сложении показателей массы препаратов (рис. 23.5).
Пример опыта in vivo может проиллюстрировать значение-всего сказанного.
Чашки до инкубации пс охлаждали, так как в случае высоких концентраций это несущественно. Активность комбинированного препарата сравнивали с активностью его компонентов (6 зон, из них 2 комбинированного препарата и по 2 каждого компонента).
Используя в первую очередь штамм В (и затем 7 других для сравнения), была установлена возможность построения калибровочной кривой на основе зависимости радиуса зоны ингибирования (16-часовая инкубация при37°С) от логарифма концентрации (мкг в 0,02 мл) для ампициллина, пенициллина G, метициллина, фене-тициллина, клоксациллина, канамицииа, неомицина, нитрофуран-тоина, полимиксина В, тетрациклина, стрептомицина, эритромицина, новобиоцина и хлорамфеникола.
Исходя из этого положения, животных забивают, отбирают соответствующие ткани и исследуют наиболее чувствительным методом содержание антибиотиков. В случае обнаружения пенициллина следующую группу животных забивают по истечении более длительного срока после введения препарата;, такую процедуру повторяют до получения отрицательных результатов.
Вопрос персистенции остатков антибиотиков в молоке после использования полусинтетических пенициллинов для интрацистернального введения при лечении клинических форм маститов у коров представляет большой интерес как для фермеров, так и для фармацевтической промышленности.
Хотя эту точку зрения разделяют многие исследователи, тем не менее ко времени публикации указанных рекомендаций обоснованность такого мнения не была столь очевидной. Дополнительные данные в поддержку рекомендаций появились позже, но их пока недостаточно.
Несмотря на интенсивные исследования по распространению резистентных к антибиотикам форм Е. coli среди домашних животных и человека, много вопросов остается без ответа.
А. Загрязнение бактериями туш красного мяса. Из всего набора микроорганизмов, обнаруженных в сыром мясе, туша может быть загрязнена кишечной флорой скорее всего при убое животных [68]. Установлено, что 52 % бычьих и 83 % свиных туш животных, убитых на коммерческих бойнях, были загрязнены Е. coli [106]. По данным американских исследователей, из 98 изолятов, выделенных из освежеванных бычьих туш, 79,6 % оказались резистентными хотя бы к одному антибактериальному агенту [11].
табл. 26. 1). Без использования селективной среды резистентные штаммы от людей выделялись редко. Современное состояние проблемы резистентности среди животных несомненно является следствием значительного и многолетнего применения антибиотиков в разных целях. Наличие большого числа резистентных к антибиотикам О-серотипов, причем значительного числа штаммов с множественной резистентностью, говорит о широком проникновении R-ллаз-мид в микрофлору кишечника животных.