1.16), очень сходные с цефалоспоринами.
Из тех данных, которые были приведены до сих пор, ясно, что на сегодняшний день имеется большой набор р-лактамных антибиотиков для перорального и инъекционного применения при лечении большинства обычных бактериальных инфекций. Все эти вещества специфически ингибируют синтез бактериальной клеточной стенки и фактически нетоксичны для клеток человека, в которые они не проникают.
Известные пенициллины и цефалоспорины достаточно активны против большинства микроорганизмов и относительно нетоксичны. Однако они способны вызвать аллергию, которую можно свести до минимума, если антибиотики использовать более осторожно и в высокоочищенной форме.
Одним из препятствий для более интенсивного применения Р-лактамных антибиотиков является наличие у некоторых штаммов ряда бактерий ферментов лактамаз, которые разрушают р-лак-тамное кольцо препарата еще до того, как он проявит свое действие на ферментную систему синтеза клеточной стенки.
принладной биохимии и питания Ноттингемсного университета, Саттон Бонингтон
Несколько десятилетий тому назад профессор С. Е. М. Джоад очень часто начинал свои сообщения с такой фразы: «Все зависит от того, что мы под этим понимаем». Эта ситуация относится и к предмету, избранному для обсуждения на данной Истеровской школе. Поэтому прежде всего мы должны иметь рабочие определения таким понятиям, как сельское хозяйство, антибиоз, антибиотик и синергизм.
Успех ко-тримоксазола в клинической практике был отмечен на целой серии симпозиумов в разных странах и подтвержден огромным количеством клинических данных [5]. В этом смысле использование ко-тримоксазола представляет собой яркое подтверждение правильности .того направления, когда совместное применение двух препаратов дает хорошие клинические результаты. Насколько успех в клинике ко-тримоксазола можно отнести за счет взаимодействия двух компонентов комбинации и какое значение имеет специфическая активность триметоприма — все это сейчас подвергается критическому анализу
Несомненный вклад каждого компонента смеси в ее активность можно показать на классическом примере синергизма между ненициллином и аминогликозидами при лечении энтерококкового эндокардита.
Таким метаболитом является тимидин, который содержится1 во многих средах. При концентрациях его менее 0,01 мкг/мл бактерицидное действие препаратов становится бактериостати-ческим, а при концентрациях около 0,1 мкг/мл бактерии начинают расти в пределах зоны ингибирования, что затрудняет определение чувствительности методом диффузии [20].
Дальнейшим доказательством того, что гибель под действием ТМП и сульфонамидов является следствием дефицита тимина, служат морфологические изменения, которые наблюдаются* у бактерий после воздействия на них летальной дозы ТМП.
Начиная с 1965 г. в качестве средства отбора тимидинзавнсимых мутантов биохимиками используется ТМП [89]. У таких мутантов нет тимидилатсинтетазы, которая в ассоциации со специфическим фолатным коферментом превращает диоксиуридилат в тимидилат, поэтому указанные мутанты удовлетворяют свою потребность в этом ферменте за счет экзогенного тимидина или тимина. Эти микроорганизмы резистентны к ТМП, поскольку в системе, как правило, присутствуют другие антагонисты.
Более того, при концентрациях, превышающих МИК, с помощью использованной здесь модельной системы нельзя показать синергидное взаимодействие, так как исходя из теоретических соображений ТМП раньше, чем СМЗ, проявит свое ингиби-рующее действие и как бы экранирует активность последнего. При инфекциях мочеполового тракта, когда относительно просто удается достичь и поддерживать высокую концентрацию ТМП, трудно оценить то преимущество, которое ожидается от добавки СМЗ, если эта добавка не предотвращает спонтанное появление мутантов, резистентных к ТМП.
Энтерококки умеренно чувствительны к бензилпенициллину,. амоксициллину и ампициллину, рост микробов подавляется при относительно низких концентрациях пенициллинов (табл. 7.1). Ами-ногликозиды менее активны против этих микроорганизмов, в ком-
'бинации с пснициллинами они значительно увеличивают активность, особенно такие новые препараты, как гентамицин и тобра-мицин. Против Streptococcus faecalis пеницнллины проявляют бактерицидное действие в меньшей степени, чем против многих других бактерий, так как после контакта с пенициллинами в этой культуре остается большое число выживших бактерий.
При большей концентрации клоксациллина (100 мкг/мл) почти полностью исключалось разрушение ампициллина (10 мкг/мл) и бактерицидный эффект полностью сохранялся в течение 24 ч. Комбинация, включающая по 100 мкг/мл каждого пенициллина, стерилизовала культуру, и заметного разрушения ампициллина не отмечалось даже через 24 ч.
Хотя использование принципа ингибирования 6-лактамазы для воздействия на резистентные бактерии и представляет значительный интерес, однако клиническое применение комбинации пенициллинов для этой цели ограничено [14,29,32].
Все аминокислоты, за исключением редких (лантионина и р-метиллантио-нина) имеют обычную L-конфигурацию.
Низин применяется как добавка при тепловой консервации продуктов. Другие области его применения, например при приготовлении сычужного сыра и для подкормки животных, будут рассмотрены ниже. Добавление низина в продукты позволяет усреднить температуру их тепловой обработки от обычно используемой (от 4,5° до —15,5 °С) до —16 °С, что соответствует величине минимального теплового воздействия, необходимого для разрушения спор CI.
При разделении в полиакрил-амидном геле получены значения 14000 и 7000 [62], что в определенной степени подтвердило прежние результаты, рассчитанные по величине коэффициента диффузии и аминокислотного состава. На основании ультрацентрифугирования и гельхроматографии молекулярная масса нативного низина была принята равной 7000. В определенных условиях низин способен распадаться на две субъединицы с молекулярной массой 3500 каждая или образовывать димер с молекулярной массой 14 ООО.
Опасность патогенных и резистентных к низину бактерий. Стерилизация содержащих низин слабокислых продуктов (рН 4,5 и ниже) при —16 °С (что эффективно против спор CI. botulinum) должна полностью исключать опасность поражения ботулизмом. Теоретически высокие гигиенические требования стандартов, регламентирующих использование низина для обработки пищевых продуктов, также не оставляют никакого риска бактериального отравления.
Среди видов бактерий, используемых в качестве закваски, нет штаммов, обладающих естественной резистентностью к такому количеству низина, которое обнаружено в сыре, полученном с НП-закваской. Кроме того, они, видимо, не вырабатывают низиназу.
Второй период изучения НП-заквасок начался после приобретения некоторого опыта работы со штаммами для закваски, когда была поставлена задача адаптировать их к росту и нормальному сбраживанию лактозы в присутствии низина [38, 125].
Ученых, работающих в области пищевой промышленности, постоянно интересует вопрос, насколько эффективно при переработке продуктов разрушаются нежелательные микроорганизмы. Поэтому выживание микробов и влияющие на это факторы всегда и оправданно составляли большую часть литературы по микробиологии пищевых продуктов. В ранней литературе бактериальная клетка рассматривалась либо как живая, либо как мертвая, и концепция восстанавливаемых повреждений не была частью общих представлений о механизмах гибели бактерий.
Важное значение рН 5,2 было случайно показано также в серии опытов, когда стафилококки вводили непосредственно в сырное зерно. Сырную массу зернили в фосфатном буфере и заражали тремя штаммами стафилококков в концентрации 104 клеток м/л при рН 4,6; через 5 дней величина рН снижалась до 3,8. Число бактерий
всех трех штаммов за 4 дня снизилось до неизмеримого уровня (рис. 10.4).
Сыры чеддер и голубой стилтон, подвергнутые зернению в цитратном буфере, инокулировали утилизирующим цитрат стафилококком кишечной группы.
Имеются лишь данные об идентификации раце-мазы у Staph, aureus и характеристике этого фермента у некоторых стрептококков [21, 22]. В этой области, вероятно, необходимы дальнейшие исследования.
Стартовую культуру определенного штамма Str. lactis вводили в виде 1%-ного инокулята в свежий сырный сгусток, к которому была добавлена соль до концентрации 25 %. Затем в полученную смесь добавляли культуру Staph, aureus MF 31, подвергнутую тепловому шоку при 52 °С в течение 15 мин.
В таких сырах прогретые стафилококки не обнаруживались совершенно, что было подтверждено и во втором опыте. Непрогретые бактерии в течение первых трех недель давали такую же кривую роста, как и образцы с первого завода, после чего их число резко сокращалось (рис. 10.13). У сырных сгустков с этих заводов были отмечены два различия. Сгусток со второго завода имел более плотную консистенцию и был засолен более сильно при машинной засолке, чем сгусток с первого завода, засоленный вручную.
Только наибольшие концентрации добавленной двуокиси серы оказали заметное влияние на характер кривых роста всех четырех штаммов. Кроме того, имеются ограниченные данные о слабом стимулирующем действии низких концентраций S02.
Совместное действие S02 и СО, на рост М. thermosphactum
В этом опыте бикарбонат добавляли как к сульфатированной, так и к несульфатированной среде и определяли кривые роста, как описано выше.
Однако добавление бикарбоната в пробы с концентрацией SO2 900 мг/л, по-видимому, во всех аспектах противодействует ин-гибирующему действию одной двуокиси серы в этой концентрации.
Показано [9], что причина исключительной рН-зависимости токсичности SO2 для Saccharomyces cerevisae var cllipsoides определяется присутствием в среде молекулярной SO2, которая является токсическим веществом. Было установлено, что молекулы SO2 активно переносятся через мембраны дрожжевой клетки за счет ферментативных реакций.
Полученная кривая выживания может иметь различную форму, включая прямую, но чаще всего она бывает сигмоидной с начальным «плечом» и конечным «хвостом». Значение формы кривой в свое время уже было предметом обсуждения [16, 101, 121, 123]. В отдельных случаях отклонение показателей гибели клеток от прямой линии может быть результатом использования конкретного экспериментального метода. Например, «плечи» и «хвосты» могут отражать слипание микроорганизмов, но чаще всего форму полученной кривой объяснить довольно трудно.
В качестве нейтрализаторов для некоторых химических веществ и антибиотиков нашли применение такие неионные детергенты, как твин и либрол-W. Хотя некоторые из неионных детергентов могут оказаться токсичными [63], их иногда используют в комбинации с лецитином либо последний применяют отдельно. Лецитин применяют для нейтрализации веществ, вызывающих повреждение мембраны (например, против полимиксина, соединений четвертичного аммония и хлоргексидина), причем его активность как детоксификанта определяется в основном высокой степенью сродства к фосфолипидам.
Именно поэтому пока нет способа для подсчета абсолютного числа поврежденных клеток. Оценка метода восстановления может быть проведена только в сравнении с другими изученными методами.
В таблице 12.2 приведен перечень типов повреждений у микроорганизмов после действия различных физических и химических факторов и антибиотиков. Можно представить, что различные повреждающие факторы будут вызывать множество типов повреждения, и, наоборот, разнотипная обработка часто приводит к одинаковым последствиям.
В таблице 13.6 указаны основные типы антибактериальных препаратов, используемых при лечении болезней животных. Они распределены по спектру активности (например, активные против грамположительных и грамотрицательных бактерий, а также препараты широкого спектра действия). Все эти антибиотики имеют существенное значение для ветеринарии, однако их эффективность зависит от точности диагноза и препарата, применяемого в подходящий момент.
При острых инфекциях, вызванных Е. coli и С. pyogenes, эффективность может быть равной нулю, несмотря на систематические профилактические мероприятия.
Целесообразность терапии в период лактации не обязательно должна быть подтверждена клиническими случаями, применение ее оправдано и при субклинических формах заболевания скота, которые диагностируются непрямыми или лабораторными тестами. Датские исследователи включились в эту обширную систему
мероприятий с 1955 г.
При решении этой проблемы в области ветеринарии химик-фармаколог встречается с большими трудностями главным образом из-за высокой стоимости исследований на животных. В оптимальном варианте, как только будет отобрана новая лекарственная форма, научный работник в дальнейшем должен продолжить усилия производителя препаратов, разработав для этого соответствующие методы испытания, включая выбор контрольных стад и отдельных животных, а также следить за тем, чтобы стандарты по диагностике, оценке и безопасности препаратов и т.
Общим для всех этих и многих других работ является то, что в них отмечается преобладающее возрастание грамотрицательных инфекций. В этой связи интересно отметить, что в эру антибиотиков недостаточное внимание уделяется роли резистентности организма хозяина и оптимальным условиям питания, которые имеют непосредственное значение в поддержании здоровья людей и животных [3, 17].
Хоуэлл [15] обратила внимание на изменение картины инфекции при клинических формах мастита.
То же самое, очевидно, имеет место и в животноводстве, на что указывают недостаточно эффективные методы хозяйствования, а также изменения в обмене веществ у животных.
Третья тема дискуссии была связана с оценкой лекарственной формы препаратов для интрацистернального введения, причем эта тема особенно близка химикам-фармакологам. Одна из основных трудностей при адекватной оценке препаратов состоит в непомерно высокой стоимости их испытания in vivo.
В образцах выделений из вымени в сухостойный период антибиотики обнаруживались в течение 4—5 недель [6].
Принцип комплементации пенициллина со стрептомицином- используется в течение многих лет, так как эта комбинация лекарств может быть синергидной; этот феномен был подтвержден последними клиническими данными, которые сравнивались с определением чувствительности in vitro. В 58 случаях маститов, вызванных пенициллин- или стрептомицинрезистентными микроорганизмами, были применены комбинированные препараты этих высокбактив-
ных антибиотиков.
Вначале были выбраны два цефа-лоспорина, которые обладали достаточной активностью in vitro против микроорганизмов, вызывающих маститы. Затем эти соединения были включены в состав соответствующей основы и изучены in vivo на экспериментальных животных и в полевых условиях.
Цефоксазол-7-(3-о-хлорфенил-5-метилизоксазол-4-карбоксами-до)-цефалоспорановая кислота была включена в состав быстро всасывающихся мазей вместе с прокаин-пенициллином.
, Streptococcus sp. и E. coli; так, из 174 случаев с клиническими признаками в 139 (80 %) были получены положительные результаты. Эта лекарственная форма не оказывала раздражающего действия на вымя и приводила к снижению числа лейкоцитов в молоке в ходе лечения. Перед лечением в 89 % случаев количество лейкоцитов составляло более 2 X Ю6 в 1 мл молока, после лечения в 62 % из них — менее 0,5 X Юб в 1 мл.
Условия внутрисоскового канала не способствуют росту бактерий. Сопутствующие микроорганизмы, которые обитают в сосковом канале здоровых коров, представлены в основном коагу-лазоотрицательными стафилококками [6], очень слабо растущими in vivo. Так, в опыте на 8 коровах средний показатель выживаемости составил 0,15% [10]. Кератиновый слой соскового канала имеет особое значение для защиты молочной железы.
В 40 % образцов были обнаружены микроорганизмы, вызывающие астматический бронхит, причем в 15 % образцов содержание их было на уровне 2ХЮ5 колоний/г сухого вещества.
Применение пропионовой кислоты для обработки сена мы начали изучать еще несколько лет назад, и лишь недавно удалось добиться предотвращения перегревания сена в полевых условиях из-за развития плесени, хотя возможность этого нами была установлена в лабораторных условиях много лет тому назад.
Затем определяли число таблеток, необходимых для получения, скажем,. 50%-ного выживания в течение времени t. Предположим, что для вещества А это число равно 60.
Такой же опыт проводили с веществом В, допуская, что для-получения одинакового антибактериального эффекта за такое же-время необходимо 20 таблеток аналогичной массы. Теперь мы можем сказать, что 60 таблеток А могут заменить 20 таблеток В или 1 таблетка А может заменить 7з таблетки В.
Рассмотренную ситуацию можно значительно упростить, взяв для обоих веществ одинаковое число таблеток; этого можно добиться, если массу таблетки В сделать равной 7з массы таблетки А. В этом случае кривая аддитивности пройдет горизонтально и будет означать, что для аддитивности неважно, какие взяты таблетки (А или В), а важно, чтобы их число равнялось 60. Таким образом, заменяемость становится совершенно очевидной.
Кафедра микробиологии факультета прикладной биохимии и питания, Ноттингемсний университет, Саттон Бонинтон
Для определения степени ингибирования микроорганизмов каким-либо веществом могут быть использованы различные подходы. Эти определения можно проводить на жидкой или твердой питательной среде, используя для характеристики роста культуры величину оптической плотности (фотометр), видимый рост (нефелометр), образование газа (например, СОг) или синтез метаболитов (образование молочной кислоты).
Поэтому величина комбинированного действия двух ингибиторов была рассчитана как средняя из двух результатов. Например, если пенициллин G (Р) комбинировать с ампициллином (PN) и сделать Р нижним диском в паре, то получится один результат (табл. 24.3, графа «а»); другой результат получается, когда диск PN ставится ниже Р (табл. 24,3, графа «б»). Средние величины указаны в графе «в». Таким же образом рас-Таблиц а 24.
Пример такого исследования будет описан в разделе «Анализ синергизма».
К этой категории относятся все работы, которые дают основные сведения по фармакологии антибиотика. Фармакокинетика представляет собой изучение математической модели распределения лекарства, что позволяет охарактеризовать антибиотики и сравнить их друг с другом. Представление об организме как о двух-компартментной (двухкамерной) открытой системе было введено в ветеринарию Риггсом [6] и позднее Зивом [7].
Установлено, что в стадах молочных коров интрацистернальное введение препарата в течение короткого промежутка времени для лечения маститов или как профилактическое средство в конце периода лактации не влияет или оказывает слабое влияние на резистентность Е. coli к препарату как в самом стаде, так и в его окружении [79].
Кратковременное пероральное введение антибиотиков свиньям [21], телятам [22] и птице (79) индуцировало сначала высокую резистентность их кишечной микрофлоры, которая затем быстро снижалась.
Для поддержания существующего равновесия важно как можно строже ограничить применение антибиотиков.
Резистентные штаммы Е. coli и болезни людей
В настоящее время идет большая дискуссия о возможной неблагоприятной роли имеющихся в кишечнике резистентных штаммов Е. coli для здоровья людей [2, 18, 31, 54, 76, 78, 88]. Присутствие большого числа резистентных штаммов Е. coli в кишечнике даже-в течение длительного периода времени не обязательно приводит к каким-либо болезненным симптомам у носителей.
1.16), очень сходные с цефалоспоринами.
Из тех данных, которые были приведены до сих пор, ясно, что на сегодняшний день имеется большой набор р-лактамных антибиотиков для перорального и инъекционного применения при лечении большинства обычных бактериальных инфекций. Все эти вещества специфически ингибируют синтез бактериальной клеточной стенки и фактически нетоксичны для клеток человека, в которые они не проникают.
Известные пенициллины и цефалоспорины достаточно активны против большинства микроорганизмов и относительно нетоксичны. Однако они способны вызвать аллергию, которую можно свести до минимума, если антибиотики использовать более осторожно и в высокоочищенной форме.
Одним из препятствий для более интенсивного применения Р-лактамных антибиотиков является наличие у некоторых штаммов ряда бактерий ферментов лактамаз, которые разрушают р-лак-тамное кольцо препарата еще до того, как он проявит свое действие на ферментную систему синтеза клеточной стенки.
принладной биохимии и питания Ноттингемсного университета, Саттон Бонингтон
Несколько десятилетий тому назад профессор С. Е. М. Джоад очень часто начинал свои сообщения с такой фразы: «Все зависит от того, что мы под этим понимаем». Эта ситуация относится и к предмету, избранному для обсуждения на данной Истеровской школе. Поэтому прежде всего мы должны иметь рабочие определения таким понятиям, как сельское хозяйство, антибиоз, антибиотик и синергизм.
Успех ко-тримоксазола в клинической практике был отмечен на целой серии симпозиумов в разных странах и подтвержден огромным количеством клинических данных [5]. В этом смысле использование ко-тримоксазола представляет собой яркое подтверждение правильности .того направления, когда совместное применение двух препаратов дает хорошие клинические результаты. Насколько успех в клинике ко-тримоксазола можно отнести за счет взаимодействия двух компонентов комбинации и какое значение имеет специфическая активность триметоприма — все это сейчас подвергается критическому анализу
Несомненный вклад каждого компонента смеси в ее активность можно показать на классическом примере синергизма между ненициллином и аминогликозидами при лечении энтерококкового эндокардита.
Таким метаболитом является тимидин, который содержится1 во многих средах. При концентрациях его менее 0,01 мкг/мл бактерицидное действие препаратов становится бактериостати-ческим, а при концентрациях около 0,1 мкг/мл бактерии начинают расти в пределах зоны ингибирования, что затрудняет определение чувствительности методом диффузии [20].
Дальнейшим доказательством того, что гибель под действием ТМП и сульфонамидов является следствием дефицита тимина, служат морфологические изменения, которые наблюдаются* у бактерий после воздействия на них летальной дозы ТМП.
Начиная с 1965 г. в качестве средства отбора тимидинзавнсимых мутантов биохимиками используется ТМП [89]. У таких мутантов нет тимидилатсинтетазы, которая в ассоциации со специфическим фолатным коферментом превращает диоксиуридилат в тимидилат, поэтому указанные мутанты удовлетворяют свою потребность в этом ферменте за счет экзогенного тимидина или тимина. Эти микроорганизмы резистентны к ТМП, поскольку в системе, как правило, присутствуют другие антагонисты.
Более того, при концентрациях, превышающих МИК, с помощью использованной здесь модельной системы нельзя показать синергидное взаимодействие, так как исходя из теоретических соображений ТМП раньше, чем СМЗ, проявит свое ингиби-рующее действие и как бы экранирует активность последнего. При инфекциях мочеполового тракта, когда относительно просто удается достичь и поддерживать высокую концентрацию ТМП, трудно оценить то преимущество, которое ожидается от добавки СМЗ, если эта добавка не предотвращает спонтанное появление мутантов, резистентных к ТМП.
Энтерококки умеренно чувствительны к бензилпенициллину,. амоксициллину и ампициллину, рост микробов подавляется при относительно низких концентрациях пенициллинов (табл. 7.1). Ами-ногликозиды менее активны против этих микроорганизмов, в ком-
'бинации с пснициллинами они значительно увеличивают активность, особенно такие новые препараты, как гентамицин и тобра-мицин. Против Streptococcus faecalis пеницнллины проявляют бактерицидное действие в меньшей степени, чем против многих других бактерий, так как после контакта с пенициллинами в этой культуре остается большое число выживших бактерий.
При большей концентрации клоксациллина (100 мкг/мл) почти полностью исключалось разрушение ампициллина (10 мкг/мл) и бактерицидный эффект полностью сохранялся в течение 24 ч. Комбинация, включающая по 100 мкг/мл каждого пенициллина, стерилизовала культуру, и заметного разрушения ампициллина не отмечалось даже через 24 ч.
Хотя использование принципа ингибирования 6-лактамазы для воздействия на резистентные бактерии и представляет значительный интерес, однако клиническое применение комбинации пенициллинов для этой цели ограничено [14,29,32].
Все аминокислоты, за исключением редких (лантионина и р-метиллантио-нина) имеют обычную L-конфигурацию.
Низин применяется как добавка при тепловой консервации продуктов. Другие области его применения, например при приготовлении сычужного сыра и для подкормки животных, будут рассмотрены ниже. Добавление низина в продукты позволяет усреднить температуру их тепловой обработки от обычно используемой (от 4,5° до —15,5 °С) до —16 °С, что соответствует величине минимального теплового воздействия, необходимого для разрушения спор CI.
При разделении в полиакрил-амидном геле получены значения 14000 и 7000 [62], что в определенной степени подтвердило прежние результаты, рассчитанные по величине коэффициента диффузии и аминокислотного состава. На основании ультрацентрифугирования и гельхроматографии молекулярная масса нативного низина была принята равной 7000. В определенных условиях низин способен распадаться на две субъединицы с молекулярной массой 3500 каждая или образовывать димер с молекулярной массой 14 ООО.
Опасность патогенных и резистентных к низину бактерий. Стерилизация содержащих низин слабокислых продуктов (рН 4,5 и ниже) при —16 °С (что эффективно против спор CI. botulinum) должна полностью исключать опасность поражения ботулизмом. Теоретически высокие гигиенические требования стандартов, регламентирующих использование низина для обработки пищевых продуктов, также не оставляют никакого риска бактериального отравления.
Среди видов бактерий, используемых в качестве закваски, нет штаммов, обладающих естественной резистентностью к такому количеству низина, которое обнаружено в сыре, полученном с НП-закваской. Кроме того, они, видимо, не вырабатывают низиназу.
Второй период изучения НП-заквасок начался после приобретения некоторого опыта работы со штаммами для закваски, когда была поставлена задача адаптировать их к росту и нормальному сбраживанию лактозы в присутствии низина [38, 125].
Ученых, работающих в области пищевой промышленности, постоянно интересует вопрос, насколько эффективно при переработке продуктов разрушаются нежелательные микроорганизмы. Поэтому выживание микробов и влияющие на это факторы всегда и оправданно составляли большую часть литературы по микробиологии пищевых продуктов. В ранней литературе бактериальная клетка рассматривалась либо как живая, либо как мертвая, и концепция восстанавливаемых повреждений не была частью общих представлений о механизмах гибели бактерий.
Важное значение рН 5,2 было случайно показано также в серии опытов, когда стафилококки вводили непосредственно в сырное зерно. Сырную массу зернили в фосфатном буфере и заражали тремя штаммами стафилококков в концентрации 104 клеток м/л при рН 4,6; через 5 дней величина рН снижалась до 3,8. Число бактерий
всех трех штаммов за 4 дня снизилось до неизмеримого уровня (рис. 10.4).
Сыры чеддер и голубой стилтон, подвергнутые зернению в цитратном буфере, инокулировали утилизирующим цитрат стафилококком кишечной группы.
Имеются лишь данные об идентификации раце-мазы у Staph, aureus и характеристике этого фермента у некоторых стрептококков [21, 22]. В этой области, вероятно, необходимы дальнейшие исследования.
Стартовую культуру определенного штамма Str. lactis вводили в виде 1%-ного инокулята в свежий сырный сгусток, к которому была добавлена соль до концентрации 25 %. Затем в полученную смесь добавляли культуру Staph, aureus MF 31, подвергнутую тепловому шоку при 52 °С в течение 15 мин.
В таких сырах прогретые стафилококки не обнаруживались совершенно, что было подтверждено и во втором опыте. Непрогретые бактерии в течение первых трех недель давали такую же кривую роста, как и образцы с первого завода, после чего их число резко сокращалось (рис. 10.13). У сырных сгустков с этих заводов были отмечены два различия. Сгусток со второго завода имел более плотную консистенцию и был засолен более сильно при машинной засолке, чем сгусток с первого завода, засоленный вручную.
Только наибольшие концентрации добавленной двуокиси серы оказали заметное влияние на характер кривых роста всех четырех штаммов. Кроме того, имеются ограниченные данные о слабом стимулирующем действии низких концентраций S02.
Совместное действие S02 и СО, на рост М. thermosphactum
В этом опыте бикарбонат добавляли как к сульфатированной, так и к несульфатированной среде и определяли кривые роста, как описано выше.
Однако добавление бикарбоната в пробы с концентрацией SO2 900 мг/л, по-видимому, во всех аспектах противодействует ин-гибирующему действию одной двуокиси серы в этой концентрации.
Показано [9], что причина исключительной рН-зависимости токсичности SO2 для Saccharomyces cerevisae var cllipsoides определяется присутствием в среде молекулярной SO2, которая является токсическим веществом. Было установлено, что молекулы SO2 активно переносятся через мембраны дрожжевой клетки за счет ферментативных реакций.
Полученная кривая выживания может иметь различную форму, включая прямую, но чаще всего она бывает сигмоидной с начальным «плечом» и конечным «хвостом». Значение формы кривой в свое время уже было предметом обсуждения [16, 101, 121, 123]. В отдельных случаях отклонение показателей гибели клеток от прямой линии может быть результатом использования конкретного экспериментального метода. Например, «плечи» и «хвосты» могут отражать слипание микроорганизмов, но чаще всего форму полученной кривой объяснить довольно трудно.
В качестве нейтрализаторов для некоторых химических веществ и антибиотиков нашли применение такие неионные детергенты, как твин и либрол-W. Хотя некоторые из неионных детергентов могут оказаться токсичными [63], их иногда используют в комбинации с лецитином либо последний применяют отдельно. Лецитин применяют для нейтрализации веществ, вызывающих повреждение мембраны (например, против полимиксина, соединений четвертичного аммония и хлоргексидина), причем его активность как детоксификанта определяется в основном высокой степенью сродства к фосфолипидам.
Именно поэтому пока нет способа для подсчета абсолютного числа поврежденных клеток. Оценка метода восстановления может быть проведена только в сравнении с другими изученными методами.
В таблице 12.2 приведен перечень типов повреждений у микроорганизмов после действия различных физических и химических факторов и антибиотиков. Можно представить, что различные повреждающие факторы будут вызывать множество типов повреждения, и, наоборот, разнотипная обработка часто приводит к одинаковым последствиям.
В таблице 13.6 указаны основные типы антибактериальных препаратов, используемых при лечении болезней животных. Они распределены по спектру активности (например, активные против грамположительных и грамотрицательных бактерий, а также препараты широкого спектра действия). Все эти антибиотики имеют существенное значение для ветеринарии, однако их эффективность зависит от точности диагноза и препарата, применяемого в подходящий момент.
При острых инфекциях, вызванных Е. coli и С. pyogenes, эффективность может быть равной нулю, несмотря на систематические профилактические мероприятия.
Целесообразность терапии в период лактации не обязательно должна быть подтверждена клиническими случаями, применение ее оправдано и при субклинических формах заболевания скота, которые диагностируются непрямыми или лабораторными тестами. Датские исследователи включились в эту обширную систему
мероприятий с 1955 г.
При решении этой проблемы в области ветеринарии химик-фармаколог встречается с большими трудностями главным образом из-за высокой стоимости исследований на животных. В оптимальном варианте, как только будет отобрана новая лекарственная форма, научный работник в дальнейшем должен продолжить усилия производителя препаратов, разработав для этого соответствующие методы испытания, включая выбор контрольных стад и отдельных животных, а также следить за тем, чтобы стандарты по диагностике, оценке и безопасности препаратов и т.
Общим для всех этих и многих других работ является то, что в них отмечается преобладающее возрастание грамотрицательных инфекций. В этой связи интересно отметить, что в эру антибиотиков недостаточное внимание уделяется роли резистентности организма хозяина и оптимальным условиям питания, которые имеют непосредственное значение в поддержании здоровья людей и животных [3, 17].
Хоуэлл [15] обратила внимание на изменение картины инфекции при клинических формах мастита.
То же самое, очевидно, имеет место и в животноводстве, на что указывают недостаточно эффективные методы хозяйствования, а также изменения в обмене веществ у животных.
Третья тема дискуссии была связана с оценкой лекарственной формы препаратов для интрацистернального введения, причем эта тема особенно близка химикам-фармакологам. Одна из основных трудностей при адекватной оценке препаратов состоит в непомерно высокой стоимости их испытания in vivo.
В образцах выделений из вымени в сухостойный период антибиотики обнаруживались в течение 4—5 недель [6].
Принцип комплементации пенициллина со стрептомицином- используется в течение многих лет, так как эта комбинация лекарств может быть синергидной; этот феномен был подтвержден последними клиническими данными, которые сравнивались с определением чувствительности in vitro. В 58 случаях маститов, вызванных пенициллин- или стрептомицинрезистентными микроорганизмами, были применены комбинированные препараты этих высокбактив-
ных антибиотиков.
Вначале были выбраны два цефа-лоспорина, которые обладали достаточной активностью in vitro против микроорганизмов, вызывающих маститы. Затем эти соединения были включены в состав соответствующей основы и изучены in vivo на экспериментальных животных и в полевых условиях.
Цефоксазол-7-(3-о-хлорфенил-5-метилизоксазол-4-карбоксами-до)-цефалоспорановая кислота была включена в состав быстро всасывающихся мазей вместе с прокаин-пенициллином.
, Streptococcus sp. и E. coli; так, из 174 случаев с клиническими признаками в 139 (80 %) были получены положительные результаты. Эта лекарственная форма не оказывала раздражающего действия на вымя и приводила к снижению числа лейкоцитов в молоке в ходе лечения. Перед лечением в 89 % случаев количество лейкоцитов составляло более 2 X Ю6 в 1 мл молока, после лечения в 62 % из них — менее 0,5 X Юб в 1 мл.
Условия внутрисоскового канала не способствуют росту бактерий. Сопутствующие микроорганизмы, которые обитают в сосковом канале здоровых коров, представлены в основном коагу-лазоотрицательными стафилококками [6], очень слабо растущими in vivo. Так, в опыте на 8 коровах средний показатель выживаемости составил 0,15% [10]. Кератиновый слой соскового канала имеет особое значение для защиты молочной железы.
В 40 % образцов были обнаружены микроорганизмы, вызывающие астматический бронхит, причем в 15 % образцов содержание их было на уровне 2ХЮ5 колоний/г сухого вещества.
Применение пропионовой кислоты для обработки сена мы начали изучать еще несколько лет назад, и лишь недавно удалось добиться предотвращения перегревания сена в полевых условиях из-за развития плесени, хотя возможность этого нами была установлена в лабораторных условиях много лет тому назад.
Затем определяли число таблеток, необходимых для получения, скажем,. 50%-ного выживания в течение времени t. Предположим, что для вещества А это число равно 60.
Такой же опыт проводили с веществом В, допуская, что для-получения одинакового антибактериального эффекта за такое же-время необходимо 20 таблеток аналогичной массы. Теперь мы можем сказать, что 60 таблеток А могут заменить 20 таблеток В или 1 таблетка А может заменить 7з таблетки В.
Рассмотренную ситуацию можно значительно упростить, взяв для обоих веществ одинаковое число таблеток; этого можно добиться, если массу таблетки В сделать равной 7з массы таблетки А. В этом случае кривая аддитивности пройдет горизонтально и будет означать, что для аддитивности неважно, какие взяты таблетки (А или В), а важно, чтобы их число равнялось 60. Таким образом, заменяемость становится совершенно очевидной.
Кафедра микробиологии факультета прикладной биохимии и питания, Ноттингемсний университет, Саттон Бонинтон
Для определения степени ингибирования микроорганизмов каким-либо веществом могут быть использованы различные подходы. Эти определения можно проводить на жидкой или твердой питательной среде, используя для характеристики роста культуры величину оптической плотности (фотометр), видимый рост (нефелометр), образование газа (например, СОг) или синтез метаболитов (образование молочной кислоты).
Поэтому величина комбинированного действия двух ингибиторов была рассчитана как средняя из двух результатов. Например, если пенициллин G (Р) комбинировать с ампициллином (PN) и сделать Р нижним диском в паре, то получится один результат (табл. 24.3, графа «а»); другой результат получается, когда диск PN ставится ниже Р (табл. 24,3, графа «б»). Средние величины указаны в графе «в». Таким же образом рас-Таблиц а 24.
Пример такого исследования будет описан в разделе «Анализ синергизма».
К этой категории относятся все работы, которые дают основные сведения по фармакологии антибиотика. Фармакокинетика представляет собой изучение математической модели распределения лекарства, что позволяет охарактеризовать антибиотики и сравнить их друг с другом. Представление об организме как о двух-компартментной (двухкамерной) открытой системе было введено в ветеринарию Риггсом [6] и позднее Зивом [7].
Установлено, что в стадах молочных коров интрацистернальное введение препарата в течение короткого промежутка времени для лечения маститов или как профилактическое средство в конце периода лактации не влияет или оказывает слабое влияние на резистентность Е. coli к препарату как в самом стаде, так и в его окружении [79].
Кратковременное пероральное введение антибиотиков свиньям [21], телятам [22] и птице (79) индуцировало сначала высокую резистентность их кишечной микрофлоры, которая затем быстро снижалась.
Для поддержания существующего равновесия важно как можно строже ограничить применение антибиотиков.
Резистентные штаммы Е. coli и болезни людей
В настоящее время идет большая дискуссия о возможной неблагоприятной роли имеющихся в кишечнике резистентных штаммов Е. coli для здоровья людей [2, 18, 31, 54, 76, 78, 88]. Присутствие большого числа резистентных штаммов Е. coli в кишечнике даже-в течение длительного периода времени не обязательно приводит к каким-либо болезненным симптомам у носителей.