Хотя для более эффективного применения этих соединений может оказаться необходимым дополнительное обучение медицинского персонала, но это себя оправдает.
В ответ на вопрос: «Разумнее ли использовать цефалоспорины?» Гамильтон-Миллер и Брамфитт [13] высказали мнение, что для целенаправленной химиотерапии следует иметь два типа лекарств: первый из них должен представлять серию препаратов с очень широким спектром действия, причем каждый из них должен быть использован для первоначального подавления инфекции до того, как будет идентифицирован возбудитель.
Однако в большинстве случаев такие микроорганизмы возникают спонтанно и исчезают после прекращения применения антибиотиков. Проще говоря, микроорганизмы, несущие R-плазмиду, редко надолго остаются в организме хозяина. Однако при достаточном времени и селективном давлении, которые отмечаются при длительном непрерывном контакте с антибиотиками, такие штаммы все же можно обнаружить. Тем не менее установленный группой Ричмонда факт, что примерно 30 % Рч+-штаммов Е.
Помимо трудностей фармакокинетиче-ского порядка (связанных с достижением определенной концентрации двух веществ в одном и том же месте и в одно и то же время), имеются трудности, обусловленные природой взаимодействия двух ^антибиотиков. Условия взаимодействия в лаборатории, где осуществляется подбор относительных концентраций препаратов, условия испытания и испытуемые штаммы могут не совпадать с клиническими условиями.
римидинового остатка [5, 70]. В итоге стало ясно, что антагонисты могут конкурировать непосредственно с витамином, а не с конечными продуктами. Эта возможность подтвердилась, и вещества типа 2,4-диаминопиримидинов были отнесены к антифолатам [58].
В период первоначальных исследований Хитчингса и др. независимо от них изучение новых антибактериальных препаратов проводили Розе и др. совместно с химиками из Манчестерского университета в Англии [9, 29, 60].
О синергизме между сульфонамидами и 2, 4-диаминопирими-динами впервые сообщили Гринберг и Ричесон [43], которые установили это явление на цыплятах, зараженных Plasmodium gal-linaceum и получавших сульфадиазин и 2,4-диамино-5-(р-хлор-фенокси)-пиримидин. Ранее наблюдали сходный синергизм с про-гуанилом [42], и хотя в то время не было установлено, что после метаболических превращений прогуанил становится антифолатом, однако эти исследования навели на мысль о возможности усиления воздействия на бактериальные инфекции, когда сульфонамиды эффективны лишь частично.
К таким естественным проявлениям антибиоза добавляются некоторые новые факторы, обусловленные деятельностью человека. Низинпродуцирующие стрептококки, используемые для закваски сычужного сыра, представляют собой новую разновидность среди множества проявлений антибиоза и синергидного взаимодействия, наблюдаемых в природе. Некоторые проявления антибиоза благоприятны, другие антагонистичны для низина; и только отдельные из них, представляющие практический интерес, стали объектом исследования.
Первые представления относительно механизма инактивации низина панкреатином и трипсином теперь изменились в свете последних исследований по действию протеолитических, гидролитических и других ферментов на этот антибиотик {71, 144]. Установлено, что только а-химотрипсин инактивирует низин. Карбоксипеп-тидаза А, трипсин, эластаза, пепсин, зрепсин и подобные протеа-зы Aspergillus oryzae и Asp. parasiticus не способны разрушать низин.
В случае использования продуктов, упакованных в фольгу и предназначенных для продажи на лотках, эффективным оказалось добавление низина (100—200 ИЕ/г) при полупроизводственном изготовлении куриного паштета, макарон и кукурузных початков молочно-восковой спелости, зараженных спорообразую-щими бактериями. Опыты подтвердили возможность применения низина в этих целях [48, 155].
Аналогичное продление сроков годности с помощью низина достигается при обработке слабо стерилизованных овощных, рыбных и грибных супов.
Так, тема синергизма разбирается в работе по изучению взаимодействия антимикробных веществ и нагревания [77], а также протективных веществ и нагревания [15]. Установлено увеличение терморезистентности у салмонелл при увеличении в среде концентрации сахарозы, глюкозы, фруктозы, сорбита и глицерина. Для всех этих веществ, кроме глицерина, характерна линейная зависимость между оптической плотностью и концентрацией.
Минор и Март [48] изучили роль вторичного воздействия соли, нагревания и замораживания для первичного действия кислотности среды. В другой работе прединкубация при 0 °С увеличивала бактерицидное действие нонаноевой и деканоевой кислот на Е. coli [21]. По мнению авторов, вероятным местом действия кислот является липо-полисахаридная оболочка этих организмов. В серии работ Иен-сена и Буста [41, 42, 43] изучено влияние таких компонентов молока, как лактоза, молочные соли, казеин и сывороточные белки, на повреждение, восстановление и гибель Salmonella anatum.
Если время прединкубации довольно продолжительно, то трудно провести различие между восстановлением поврежденных микробов и ростом выживших и восстановившихся организмов [59]. Непродолжительная прединкубация, наверняка, исключала бы рост культуры, но в то же время применение ее не будет отвечать требованиям эксперимента, так как восстановление отдельных микроорганизмов может варьировать в пределах 5 ч и больше.
[24]. При пониженной температуре выработка энтеротоксина происходит медленнее, чем размножение культуры, причем указанное соотношение сохраняется при 18 °С в течение трех: дней [7]. Поскольку верхние пределы температуры для созревания сыров равны 14,5 °С для сыра стилтон и 12,8 °С для сыра: чеддер, то, очевидно, образование токсина зависит более от температуры, чем от числа микроорганизмов.
д. В большинстве случаев имеющиеся в этих источниках микроорганизмы подвержены действию одного или большего числа физических или химических стрессовых воздействий. Следовательно, в образцах могут присутствовать клетки с разной степенью сублетального повреждения, а также погибшие и здоровые клетки.
Целесообразность попыток выделения поврежденных микроорганизмов пока остается предметом дискуссии. Интерес к данной проблеме, по нашему мнению, будет всегда, так как имеющиеся данные показывают, что сублетально поврежденные клетки сохраняют способность вызывать инфекции и сохраняют исходную патогенность после оживания [114].
В результате происходит восстановление жизнеспособности поврежденных клеток и затем их размножение. Для проверки стерильности фармацевтических препаратов не обязательно использовать селективную среду. Однако, по имеющимся данным [4], поврежденные нагреванием или действием рифамицина салмонеллы (Salmonella thyphimurium) лучше восстанавливались на минимальной (глюкоза/соли) среде, чем на полноценной в питательном отношении неселективной среде [41].
В частности, для каждой серии желчно-солевой среды и среды с бриллиантовым зеленым необходимо устанавливать их токсичность [79, 86, 100]. На величину времени восстановления микроорганизмов влияет также степень тяжести повреждений.
Рекомендованные методы по выделению поврежденных клеток включают также этап оживания или предварительного обогащения их в жидкой неселективой среде в течение 5—24 ч для культур Salmonella, Enterobacieriaceae, Staph, aureus и Pseudomonas aeruginosa [3, 15, 43, 82, 118, 126, 130].
Действие антимикробных веществ основано на интерференции с живыми структурами или метаболическими процессами микроорганизмов, что приводит либо ic их гибели, либо к подавлению размножения. Указанный эффект проявляется в виде бактерицидного или бактериостатического действия, которое мы используем в наших попытках добиться быстрого и существенного оздоровления зараженного скота и повышения его продуктивности.
В случае диагностирования признаков таких специфических заболеваний, как Fusiformis, дифтерия или ак-тинобациллез, могут быть использованы следующие подходящие антибактериальные препараты: пенициллин и стрептомицин соответственно, так как известно, что эти бактерии чувствительны к указанным антибиотикам. Если же идентификация выявила неизвестный или сомнительный микроорганизм или если данную клиническую картину могут вызвать разные бактерии, то в таких случаях практика указывает на необходимость выбора препарата с
широким спектром активности, поэтому ветеринарные врачи широко используют антибиотики из группы тетрациклинов.
В 1962 г. Эдварде [9] сделал слишком смелое заявление в отношении облигатного возбудителя Strep, agalactiae, когда он писал, что «на сегодняшний день этот микроорганизм не имеет существенного значения». На основании результатов своих работ и работ других ученых он пришел к выводу, что применение пенициллина в составе препаратов для интрацистернального введения позволит быстро оздоровить стада. Действительно, в Дании в результате интенсивной профилактики удалось снизить до 1% число пораженных стад.
Терапия в сухостойный период для профилактики инфекции, вызванной С. pyogenes, имеет уже 25-летнюю историю, поэтому я с полным основанием могу утверждать: до тех пор, пока мне не докажут другое, что такой сравнительно дешевый антибиотик, как пенициллин, в виде медленно освобождающейся лекарственной формы может быть так же эффективен, как и любой другой из новых более дорогих синтетических препаратов.
В другом опыте (табл. 16.2) комбинация двух лекарств приводила к полному предотвращению смертности, сопровождаемому быстрой ремиссией симптомов. Однако двойная дозировка одного триметоприма (т. е. 8 мг/кг) не спасла от гибели 6 из 7 телят в этой группе, хотя некоторая задержка смертности была совершенно очевидной. В этом опыте было также установлено, что внутривенное введение эффективнее, чем внутримышечное.
е. уровень его становится меньше
0,02 мкг/мл). Возможное объяснение большей эффективности триметоприма in vivo состоит в том, что переходящая Персистенция препарата в сыворотке крови после внутривенного введения скоту обусловливает большее накопление лекарства в тканях, чем в сыворотке крови [2, 5]. Установлено также, что при подкожной имплантации собакам пластиковых канюль для сбора экстрацеллю-лярной жидкости количество триметоприма в экетраваскулярной жидкости не только достигает большего уровня по сравнению с сывороткой крови, но и сохраняется значительно дольше.
Тем не менее роль лииидов в защите вымени остается под вопросом, так как указанные результаты не были подтверждены другими авторами [40].
Из кератина соскового канала коровы методами кислотной экстракции и хроматографии на колонке с карбоксиметилцеллюло-зой выделены катионные антимикробные белки [12, 13]. Они растворялись в воде н разбавленной кислоте и при рН 3 образовывали шесть полос при электрофорезе в полиакриламидном геле.
Ниже описан метод комбинированного ингибирования Е. coli (тип I) разных серотипов с помощью дисков с антибиотиками (мульти-диски или диски с индивидуальными антибиотиками). Всего было испытано около 30 штаммов Е. coli, выделенных в основном при поносе телят и отнесенных к серотипам 08, 09, 015, 026, 078, 086, 0128 и 0137; два штамма были В-гемолитическими. Все они давали положительную реакцию с эозин-метиленовой синей, на агаре Мак-Конки, с индолом, метиленовым красным и реактивом Эйкмана; отрицательную реакцию с реактивом Вогез-Проскауера и при росте на цитратной среде (табл.
Эти результаты согласуются с данными других авторов [9].
Метод оценки трех веществ в основном аналогичен методу оценки двух веществ. Активность комбинации двух веществ сравнивается с активностью третьего вещества и комбинацией компонентов всех трех веществ. Если вещества А и В синергидны, то они не будут давать зону, равную 5 мм. Комбинация компонентов может быть: а) разведена для получения соответствующей концентрации или б) сравнима по величине зон подавления с А+В, с A-f-В+С и с зоной одного С.
Внедрение в практику комбинации ампициллина и клоксациллина , предназначенных для интрацистернального введения, оказалось сопряженным с большими техническими трудностями. Вначале предполагалось, что для регистрации этого препарата в Комитете ветеринарных препаратов, входящем в состав Медицинской комиссии, достаточным окажется микробиологическое определение общей активности использованной комбинации.
coli, выделенных из прямой кишки телят, свиней и птицы. Поскольку культуры были выделены на среде без антибиотиков и поэтому не селекционировались, то они характеризуют основные штаммы микрофлоры кала обследованных животных. В указанной таблице даны предварительные данные по группе животных, от которых был выделен каждый серотип; включены также резистентные штаммы /;'. coli от людей. Прямое сравнение невозможно, поскольку резистентные штаммы от людей были выделены на среде с антибиотиками, и, следовательно, они представляют собой не все штаммы.
Хотя для более эффективного применения этих соединений может оказаться необходимым дополнительное обучение медицинского персонала, но это себя оправдает.
В ответ на вопрос: «Разумнее ли использовать цефалоспорины?» Гамильтон-Миллер и Брамфитт [13] высказали мнение, что для целенаправленной химиотерапии следует иметь два типа лекарств: первый из них должен представлять серию препаратов с очень широким спектром действия, причем каждый из них должен быть использован для первоначального подавления инфекции до того, как будет идентифицирован возбудитель.
Однако в большинстве случаев такие микроорганизмы возникают спонтанно и исчезают после прекращения применения антибиотиков. Проще говоря, микроорганизмы, несущие R-плазмиду, редко надолго остаются в организме хозяина. Однако при достаточном времени и селективном давлении, которые отмечаются при длительном непрерывном контакте с антибиотиками, такие штаммы все же можно обнаружить. Тем не менее установленный группой Ричмонда факт, что примерно 30 % Рч+-штаммов Е.
Помимо трудностей фармакокинетиче-ского порядка (связанных с достижением определенной концентрации двух веществ в одном и том же месте и в одно и то же время), имеются трудности, обусловленные природой взаимодействия двух ^антибиотиков. Условия взаимодействия в лаборатории, где осуществляется подбор относительных концентраций препаратов, условия испытания и испытуемые штаммы могут не совпадать с клиническими условиями.
римидинового остатка [5, 70]. В итоге стало ясно, что антагонисты могут конкурировать непосредственно с витамином, а не с конечными продуктами. Эта возможность подтвердилась, и вещества типа 2,4-диаминопиримидинов были отнесены к антифолатам [58].
В период первоначальных исследований Хитчингса и др. независимо от них изучение новых антибактериальных препаратов проводили Розе и др. совместно с химиками из Манчестерского университета в Англии [9, 29, 60].
О синергизме между сульфонамидами и 2, 4-диаминопирими-динами впервые сообщили Гринберг и Ричесон [43], которые установили это явление на цыплятах, зараженных Plasmodium gal-linaceum и получавших сульфадиазин и 2,4-диамино-5-(р-хлор-фенокси)-пиримидин. Ранее наблюдали сходный синергизм с про-гуанилом [42], и хотя в то время не было установлено, что после метаболических превращений прогуанил становится антифолатом, однако эти исследования навели на мысль о возможности усиления воздействия на бактериальные инфекции, когда сульфонамиды эффективны лишь частично.
К таким естественным проявлениям антибиоза добавляются некоторые новые факторы, обусловленные деятельностью человека. Низинпродуцирующие стрептококки, используемые для закваски сычужного сыра, представляют собой новую разновидность среди множества проявлений антибиоза и синергидного взаимодействия, наблюдаемых в природе. Некоторые проявления антибиоза благоприятны, другие антагонистичны для низина; и только отдельные из них, представляющие практический интерес, стали объектом исследования.
Первые представления относительно механизма инактивации низина панкреатином и трипсином теперь изменились в свете последних исследований по действию протеолитических, гидролитических и других ферментов на этот антибиотик {71, 144]. Установлено, что только а-химотрипсин инактивирует низин. Карбоксипеп-тидаза А, трипсин, эластаза, пепсин, зрепсин и подобные протеа-зы Aspergillus oryzae и Asp. parasiticus не способны разрушать низин.
В случае использования продуктов, упакованных в фольгу и предназначенных для продажи на лотках, эффективным оказалось добавление низина (100—200 ИЕ/г) при полупроизводственном изготовлении куриного паштета, макарон и кукурузных початков молочно-восковой спелости, зараженных спорообразую-щими бактериями. Опыты подтвердили возможность применения низина в этих целях [48, 155].
Аналогичное продление сроков годности с помощью низина достигается при обработке слабо стерилизованных овощных, рыбных и грибных супов.
Так, тема синергизма разбирается в работе по изучению взаимодействия антимикробных веществ и нагревания [77], а также протективных веществ и нагревания [15]. Установлено увеличение терморезистентности у салмонелл при увеличении в среде концентрации сахарозы, глюкозы, фруктозы, сорбита и глицерина. Для всех этих веществ, кроме глицерина, характерна линейная зависимость между оптической плотностью и концентрацией.
Минор и Март [48] изучили роль вторичного воздействия соли, нагревания и замораживания для первичного действия кислотности среды. В другой работе прединкубация при 0 °С увеличивала бактерицидное действие нонаноевой и деканоевой кислот на Е. coli [21]. По мнению авторов, вероятным местом действия кислот является липо-полисахаридная оболочка этих организмов. В серии работ Иен-сена и Буста [41, 42, 43] изучено влияние таких компонентов молока, как лактоза, молочные соли, казеин и сывороточные белки, на повреждение, восстановление и гибель Salmonella anatum.
Если время прединкубации довольно продолжительно, то трудно провести различие между восстановлением поврежденных микробов и ростом выживших и восстановившихся организмов [59]. Непродолжительная прединкубация, наверняка, исключала бы рост культуры, но в то же время применение ее не будет отвечать требованиям эксперимента, так как восстановление отдельных микроорганизмов может варьировать в пределах 5 ч и больше.
[24]. При пониженной температуре выработка энтеротоксина происходит медленнее, чем размножение культуры, причем указанное соотношение сохраняется при 18 °С в течение трех: дней [7]. Поскольку верхние пределы температуры для созревания сыров равны 14,5 °С для сыра стилтон и 12,8 °С для сыра: чеддер, то, очевидно, образование токсина зависит более от температуры, чем от числа микроорганизмов.
д. В большинстве случаев имеющиеся в этих источниках микроорганизмы подвержены действию одного или большего числа физических или химических стрессовых воздействий. Следовательно, в образцах могут присутствовать клетки с разной степенью сублетального повреждения, а также погибшие и здоровые клетки.
Целесообразность попыток выделения поврежденных микроорганизмов пока остается предметом дискуссии. Интерес к данной проблеме, по нашему мнению, будет всегда, так как имеющиеся данные показывают, что сублетально поврежденные клетки сохраняют способность вызывать инфекции и сохраняют исходную патогенность после оживания [114].
В результате происходит восстановление жизнеспособности поврежденных клеток и затем их размножение. Для проверки стерильности фармацевтических препаратов не обязательно использовать селективную среду. Однако, по имеющимся данным [4], поврежденные нагреванием или действием рифамицина салмонеллы (Salmonella thyphimurium) лучше восстанавливались на минимальной (глюкоза/соли) среде, чем на полноценной в питательном отношении неселективной среде [41].
В частности, для каждой серии желчно-солевой среды и среды с бриллиантовым зеленым необходимо устанавливать их токсичность [79, 86, 100]. На величину времени восстановления микроорганизмов влияет также степень тяжести повреждений.
Рекомендованные методы по выделению поврежденных клеток включают также этап оживания или предварительного обогащения их в жидкой неселективой среде в течение 5—24 ч для культур Salmonella, Enterobacieriaceae, Staph, aureus и Pseudomonas aeruginosa [3, 15, 43, 82, 118, 126, 130].
Действие антимикробных веществ основано на интерференции с живыми структурами или метаболическими процессами микроорганизмов, что приводит либо ic их гибели, либо к подавлению размножения. Указанный эффект проявляется в виде бактерицидного или бактериостатического действия, которое мы используем в наших попытках добиться быстрого и существенного оздоровления зараженного скота и повышения его продуктивности.
В случае диагностирования признаков таких специфических заболеваний, как Fusiformis, дифтерия или ак-тинобациллез, могут быть использованы следующие подходящие антибактериальные препараты: пенициллин и стрептомицин соответственно, так как известно, что эти бактерии чувствительны к указанным антибиотикам. Если же идентификация выявила неизвестный или сомнительный микроорганизм или если данную клиническую картину могут вызвать разные бактерии, то в таких случаях практика указывает на необходимость выбора препарата с
широким спектром активности, поэтому ветеринарные врачи широко используют антибиотики из группы тетрациклинов.
В 1962 г. Эдварде [9] сделал слишком смелое заявление в отношении облигатного возбудителя Strep, agalactiae, когда он писал, что «на сегодняшний день этот микроорганизм не имеет существенного значения». На основании результатов своих работ и работ других ученых он пришел к выводу, что применение пенициллина в составе препаратов для интрацистернального введения позволит быстро оздоровить стада. Действительно, в Дании в результате интенсивной профилактики удалось снизить до 1% число пораженных стад.
Терапия в сухостойный период для профилактики инфекции, вызванной С. pyogenes, имеет уже 25-летнюю историю, поэтому я с полным основанием могу утверждать: до тех пор, пока мне не докажут другое, что такой сравнительно дешевый антибиотик, как пенициллин, в виде медленно освобождающейся лекарственной формы может быть так же эффективен, как и любой другой из новых более дорогих синтетических препаратов.
В другом опыте (табл. 16.2) комбинация двух лекарств приводила к полному предотвращению смертности, сопровождаемому быстрой ремиссией симптомов. Однако двойная дозировка одного триметоприма (т. е. 8 мг/кг) не спасла от гибели 6 из 7 телят в этой группе, хотя некоторая задержка смертности была совершенно очевидной. В этом опыте было также установлено, что внутривенное введение эффективнее, чем внутримышечное.
е. уровень его становится меньше
0,02 мкг/мл). Возможное объяснение большей эффективности триметоприма in vivo состоит в том, что переходящая Персистенция препарата в сыворотке крови после внутривенного введения скоту обусловливает большее накопление лекарства в тканях, чем в сыворотке крови [2, 5]. Установлено также, что при подкожной имплантации собакам пластиковых канюль для сбора экстрацеллю-лярной жидкости количество триметоприма в экетраваскулярной жидкости не только достигает большего уровня по сравнению с сывороткой крови, но и сохраняется значительно дольше.
Тем не менее роль лииидов в защите вымени остается под вопросом, так как указанные результаты не были подтверждены другими авторами [40].
Из кератина соскового канала коровы методами кислотной экстракции и хроматографии на колонке с карбоксиметилцеллюло-зой выделены катионные антимикробные белки [12, 13]. Они растворялись в воде н разбавленной кислоте и при рН 3 образовывали шесть полос при электрофорезе в полиакриламидном геле.
Ниже описан метод комбинированного ингибирования Е. coli (тип I) разных серотипов с помощью дисков с антибиотиками (мульти-диски или диски с индивидуальными антибиотиками). Всего было испытано около 30 штаммов Е. coli, выделенных в основном при поносе телят и отнесенных к серотипам 08, 09, 015, 026, 078, 086, 0128 и 0137; два штамма были В-гемолитическими. Все они давали положительную реакцию с эозин-метиленовой синей, на агаре Мак-Конки, с индолом, метиленовым красным и реактивом Эйкмана; отрицательную реакцию с реактивом Вогез-Проскауера и при росте на цитратной среде (табл.
Эти результаты согласуются с данными других авторов [9].
Метод оценки трех веществ в основном аналогичен методу оценки двух веществ. Активность комбинации двух веществ сравнивается с активностью третьего вещества и комбинацией компонентов всех трех веществ. Если вещества А и В синергидны, то они не будут давать зону, равную 5 мм. Комбинация компонентов может быть: а) разведена для получения соответствующей концентрации или б) сравнима по величине зон подавления с А+В, с A-f-В+С и с зоной одного С.
Внедрение в практику комбинации ампициллина и клоксациллина , предназначенных для интрацистернального введения, оказалось сопряженным с большими техническими трудностями. Вначале предполагалось, что для регистрации этого препарата в Комитете ветеринарных препаратов, входящем в состав Медицинской комиссии, достаточным окажется микробиологическое определение общей активности использованной комбинации.
coli, выделенных из прямой кишки телят, свиней и птицы. Поскольку культуры были выделены на среде без антибиотиков и поэтому не селекционировались, то они характеризуют основные штаммы микрофлоры кала обследованных животных. В указанной таблице даны предварительные данные по группе животных, от которых был выделен каждый серотип; включены также резистентные штаммы /;'. coli от людей. Прямое сравнение невозможно, поскольку резистентные штаммы от людей были выделены на среде с антибиотиками, и, следовательно, они представляют собой не все штаммы.